核酸质量检测——琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作为介质的一种电泳方法，其兼具“分子筛”和“电泳的双重作用。
琼脂糖(Agarose)是一种线性多糖聚合物，是从红色海藻产物琼脂中提取而来的，当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。
经过化学修饰的低熔点的琼脂糖，在结构上比较脆弱，因此在较低的温度下便会熔化，可用于核酸片段的电泳检测。
琼脂糖凝胶电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出电泳分离范围)，该方法的可信度非常高。
琼脂糖凝胶电泳的原理
荧光染料检测核酸的存在
观察琼脂凝胶中核酸的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭 (EB) 进行染色，所用的荧光染料含有一个可以嵌入核酸的堆积碱基之间的荧光基团，当染料与核酸结合后呈现荧光。
核酸吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，被结合的染料本身在302nm和366nm有光吸收，这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来，因此，当凝胶中含有游离的EB时即可以检测到DNA和RNA的存在。
注1：由于EB具有很强的毒性，因此在操作时一定要戴手套，并且最好有专门的区域进行电泳检测实验。
注2：可以使用GoldView染料代替EB，其具有相同的检测效果，同时毒性要低很多。
电泳区分核酸大小
核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，琼脂糖凝胶电泳即根据这个原理对核酸进行区分。
核酸分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于核酸的戊糖-磷酸骨架在结构上具有重复性，长度相同的核酸链几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
此外，含有琼脂糖的凝胶具有网状结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在琼脂糖凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
在同样电场的强度下，核酸分子的迁移速度取决于核酸分子本身的大小和构型以及琼脂糖凝胶的浓度，简而言之，分子量较大的核酸迁移速度较慢，分子量较小的核酸迁移速度较快，这就是应用凝胶电泳技术分离核酸片段的基本原理。
琼脂糖凝胶电泳的操作
试剂配置
5×TBE储备液：
Tris，54g；
硼酸，27.5g；
0.5M EDTA，20mL，pH为8.0；
蒸馏水1000mL；
4摄氏度保存。
注1：0.5M EDTA配置：向18.61g EDTA中加入一定量的双蒸水，用NaOH调节pH至8.0，之后在用100mL容量瓶定量。
注2：使用时将储存液稀释10倍至0.5×，作为电泳及制胶的缓冲液。
注3：5×TBE缓冲液放置时间过久会沉淀，因此一次性不要配太多。
注4：工作用电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液，最好现配现用。
制胶
根椐制胶量及凝胶浓度，向三角锥形瓶中加入指定体积的0.5×TBE缓冲液和准确称量的琼脂糖粉；
将锥形瓶放入微波炉中加热溶解琼脂糖；
使溶液冷却至50℃～60℃左右，加入EB染料，并充分混匀；
将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子；
在室温下使胶凝固，大约30分钟~1小时。
其它注意事项：
一般小胶需要缓冲液30～40mL，大胶70～80mL；
加热火力不要太大，以防缓冲液沸腾后溢出锥形瓶；
可以反复多次加热，以保证琼脂糖完全溶解；
如使用GoldView染料，加热后无需冷却即可直接添加染料；
染料添加量为小胶2μL，大胶4μL。
上样
取适量样品与6×loading buffer混匀 (一般为5μl样品加1μl 6×loading buffer)，用微量移液枪小心加入样品孔中；
将5μl marker用微量移液枪小心加入到样品孔中；
每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染；
注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
电泳
加完样后，合上电泳槽盖，接通电源；
设置合适的电压和电流，开始电泳；
当条带移动到胶块2/3以上时，停止电泳；
在凝胶成像系统中拍照并观察。
检测DNA一般采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳，低电压长时间进行，至少要用lambda DNA或Hind III DNA marker。
检测RNA一般采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳，电压150V～180V，电泳30min左右。
琼脂糖凝胶电泳的结果
理想的电泳结果
DNA的电泳：如果在23kb处有一条完整或略脱尾的条带，则证明DNA完整性很好。
RNA电泳中一般会出现3个条带，分别为28S、18S和5S rRNA，有时5S rRNA检测不到。
电泳结果异常及可能原因分析
加样孔有荧光
出现这种情况通常为蛋白质残留，虽然蛋白质不会被荧光染料染色，但蛋白质会与比较大的核酸结合，使得核酸不能跑出上样孔，因而在孔中产生荧光。
核酸降解
核酸降解的现象主要表现为，主带并不突出，向小片段方向发生弥散，亮度比较均衡地衰减。
以目前核酸提取方法的能力，在裂解和提取过程中除了操作失误几乎并不会导致核酸的降解，所以出现提取核酸降解的情况，一般为样品本身在提取前就有一定程度的核酸降解。
样品本身出现核酸降解一般分为两种，一种是样品采集和保存出现问题，比如以RNA提取为目的的样品在采集后在常温下存放了很长时间；另一种是样品本身就存在一定的核酸降解，比如土壤或沉积物样品中本身就存在很多长短不一的胞外DNA。
核酸提取失败
一般核酸提取失败的结果显示为没有明显的主带，而是在一个较大的范围内呈现弥散状态。
不同类型核酸残留
在DNA或RNA提取过程中，可能会出现其它类型核酸残留的现象，比如在提取的DNA中存在RNA残留，或者在提取的RNA中存在DNA残留，此时的电泳结果会同时观察到DNA和RNA。
针对这种情况的处理办法是在提取过程中添加一步DNase或RNase的处理，以去除不是提取目标的核酸。
制胶不合格
如果电泳的结果显示marker跑的都有问题，那一般就是制胶的过程出现了问题，建议首先重新配置TBE缓冲液，并重新制胶，确保在制胶过程中琼脂糖混合均匀。
其次是要更换电泳槽中的缓冲液，电泳槽中缓冲液使用时间过长会影响其导电能力。
如果问题依然出现，就要考虑是不是琼脂糖的问题，现在国内市场上假的琼脂糖非常多，本人就遇到过因为琼脂糖是山寨货而导致电泳一直出现问题的情况。
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